狂犬病作为一种人兽共患病,每年大约会造成6万人死亡。然而,根据世界卫生组织的数据,它仍然是发展中国家最被忽视的疾病之一。人狂犬病疫苗接种是暴露前和暴露后预防的重要组成环节[1]。
我国狂苗使用多种细胞系,包括Vero细胞、地鼠肾细胞、鸡胚及人二倍体细胞。Vero细胞是目前狂犬疫苗的主流细胞系,具有培养效率高、外源性污染低、病毒滴度高等优势。同时,Vero细胞狂苗提纯工艺简单高效,易于放大,可以为企业带来更高的生产效益。
图1:2017~2020中国狂犬疫苗品种批签发数量(万支)
病毒收获液的滴度是影响疫苗效价的一个关键因素,《中国药典》也对狂犬疫苗的检定作出了要求。采用转瓶进行生产所收获的病毒原液毒力较低,经纯化后很难生产出合格的狂犬病疫苗,而通过生物反应器对细胞进行高密度的培养,可以制备出高毒力的病毒收获液,从而提高狂犬病疫苗的效价。
《中国药典》对冻干人用狂犬疫苗(Vero细胞)的检定要求(节选)
✦ 病毒滴定:病毒滴度应不低于6.0 lg LD50/mL
✦ 蛋白质含量:取纯化后未加入人血白蛋白的病毒液,应不高于80μg/剂
✦ Vero细胞DNA残留:采用荧光定量PCR法,应不高于3ng/剂
✦ 效价测定:应不低于2.5IU/剂
✦ Vero细胞蛋白质残留量:采用酶联免疫吸附法,应不高于6.0μg/剂
高密度培养离不开片状载体系统。赛科成的篮式搅拌桨,搭载片状载体的高密度和高活力细胞灌流培养模式,不仅为病毒扩增提供了相对稳定的培养环境,还延长了病毒培养时间并增加了收获量,在一定程度上减小了批间差异、缩小了生产空间和时间,在降低经济投入的同时保证了产品均一性[2]。而由于片状载体对细胞的贴壁性能很强,可在灌流过程中轻松收获上清中的病毒,且宿主蛋白和DNA含量降低,更有利于下游纯化[3]。
图2:赛科成片状载体
狂犬疫苗制备工艺流程:
图3:狂犬疫苗制备工艺流程图[5]
赛科成专利片状载体细胞培养袋,将片状载体预填充在一次性培养袋中,并进行辐照灭菌。片状载体袋可以配合SKC600摆床反应器使用,实现高密度灌流培养。1个2L的片状载体袋提供的贴壁面积为36,000cm2,相当于16个15000ml转瓶、160个方瓶或56层细胞工厂。
图4:赛科成技术支持团队演示片状载体袋手工消化技术
结语:
参考文献:
[1] Giesen A, Gniel D, Malerczyk C. 30 Years of rabies vaccination with Rabipur: a summary of clinical data and global experience. Expert Rev Vaccines. 2015 Mar;14(3):351-67. doi: 10.1586/14760584.2015.1011134. Erratum in: Expert Rev Vaccines. 2015 May;14(5):775. doi: 10.1586/14760584.2015.1027863. PMID: 25683583.
[2] LAI Z C,WENG T,ZENG J H,et al. Evaluation of novel dis ‐ posable bioreactors on pandemic influenza virus production[J]. PLoS One,2019,14(8):e0220803. DOI:10. 1371/journal. pone. 0220803.(in Chinese)
[3] RHAZI H,SSAFINI N,MIKOU K,et al. Production of small ruminant morbillivirus,rift valley fever virus and lumpy skin disease virus in CelCradle ‐500A bioreactors[J]. BMC Vet Res, 2021,17(1):93
[4] CESCON D W,HAIBE ‐KAINS B,MAK T W. APOBEC3B ex‐ pression in breast cancer reflects cellular proliferation,while a deletion polymorphism is associated with immune activation [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112(9):2841‐2846
[5] 杨屹,汝东宇,郭秀侠,崔文广,苗丽,刘岩,王亚军,蔡月红,苑志刚.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志,2011,24(5):583-585,589.960
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